На прошлой неделе было объявлено, что Нобелевскую премию по химии 2017 года получат швейцарец Жак Дюбоше, американец немецкого происхождения Йоахим Франк и шотландец Ричард Хендерсон за «разработку методов криоэлектронной микроскопии высокого разрешения для определения трехмерных структур биомолекул в растворе». Их работы позволили, начиная с 80-х годов прошлого века, опробовать и постепенно усовершенствовать этот вид микроскопии до такой степени, что в последние годы ученые могут рассматривать сложные биологические молекулы в мельчайших деталях. Нобелевский комитет отметил, что метод криоэлектронной микроскопии перевел биохимию в новую эру, позволяя заполнить множество пробелов в знаниях о молекулах жизни и живых системах.
Сразу отметим, что вряд ли можно называть криогенную электронную микроскопию принципиально новым и самодостаточным методом физического исследования вещества. Скорее, она является разновидностью просвечивающей электронной микроскопии (один из авторов этого метода, Эрнст Руска , получил Нобелевскую премию в 1986 году), которую специально адаптировали для изучения микробиологических объектов.
В просвечивающем электронном микроскопе через достаточно тонкий образец, чтобы он был прозрачным для электронов (обычно это десятые и сотые доли микрона), пропускают пучок электронов, которые, проходя через образец, поглощаются и рассеиваются, меняя направление движения. Эти изменения можно зарегистрировать (сейчас в качестве детектора чаще всего используется ПЗС-матрица , создатели которой, Уиллард Бойл и Джордж Смит , стали лауреатами ) и, после анализа, получить изображение исследуемого объекта в плоскости, перпендикулярной пучку. Поскольку собственная длина волны электронов (десятки пикометров при энергиях, характерных для электронных микроскопов) много меньше длин волн света в видимой области (сотни нанометров), с помощью электронной микроскопии можно «разглядеть» гораздо более тонкие детали, чем с помощью оптической микроскопии, в том числе и флуоресцентной микроскопии высокого разрешения (ФМВР), разработанной лауреатами Эриком Бетцигом , Штефаном Хеллем и Уильямом Мернером .
Предельная разрешающая способность электронных микроскопов - несколько ангстрем (десятые доли нанометра) - уже почти достигнута. Это позволяет получать изображения, на которых, например, различимы отдельные атомы. Для сравнения: предел возможностей ФМВР - 10–20 нм. Но просто так сравнивать разные методы по предельному разрешению довольно бессмысленно. Электронные микроскопы имеют высокое разрешение, но им не всегда можно воспользоваться. Дело в том, что образец, помимо измельчения при подготовке, во время самого исследования подвергается довольно серьезному облучению пучком электронов (грубо говоря, чем интенсивнее пучок, тем меньше ошибок и тем лучше получается результат), находясь при этом в вакууме (вакуум нужен, чтобы среда не рассеивала электроны вне образца, внося тем самым лишние искажения). Такие условия совершенно не подходят, если нужно изучать сложно устроенные биологические молекулы и объекты - они повреждаются в разреженной среде и в них много довольно слабых связей, которые просто будут разрушаться во время исследования.
Понимание того, что без дополнительных усовершенствований электронный микроскоп нельзя будет приспособить к изучению биомолекул и живых систем, появилось почти сразу после его изобретения. Об этом, например, писал спустя три года после демонстрации принципа работы электронного микроскопа Эрнстом Руской в 1931 году венгерский физик Ладислав Мартон (L. Marton, 1934. Electron Microscopy of Biological Objects). В той же статье Мартон предложил и пути решения этой проблемы. В частности, он же указал, что замораживание образцов может снизить ущерб от облучения пучком электронов. Важно отметить, что, хотя в статье Мартона это и не указано, замораживание образца помогает еще и тем, что снижает тепловое колебание молекул, что тоже способствует улучшению получаемого изображения.
В 1970–80-е годы наука и техника достигли достаточного уровня развития, чтобы преодолеть все трудности. И это произошло во многом благодаря усилиям лауреатов премии этого года.
Ричард Хендерсон был первым, кто получил при помощи просвечивающей электронной микроскопии (с охлаждением образца) изображение несимметричного белка с атомным разрешением. Свои исследования он начал еще в середине 70-х годов. Причем сперва Хендерсон пытался получить структуру нескольких белков из клеточной мембраны, используя метод рентгеноструктурного анализа , который уже тогда мог давать разрешение в несколько ангстрем. Однако быстро стало ясно, что этим способом хорошего результата не добиться: исследуемое вещество должно быть в кристаллической форме, а мембранные белки, извлеченные из своего окружения, либо плохо кристаллизуются, либо вообще теряют форму. Тогда он переключился на электронную микроскопию.
Был выбран конкретный белок - бактериородопсин - и было решено не извлекать его из мембраны, а исследовать прямо в ней. Ученые дополнительно покрывали образцы раствором глюкозы, чтобы защитить его от высыхания в вакууме. Это помогло решить проблему с сохранением структуры. Затем Хендерсон с коллегами столкнулись с уже описанной проблемой разрушения образцов под действием пучка электронов. Ее помогло решить сочетание нескольких факторов.
Во-первых, бактериородопсин располагается в мембране регулярно, поэтому аккуратный учет этой регулярности в сочетании со съемкой под разными углами сильно помогает при построении картинки. Это помогло снизить интенсивность пучка и сократить время экспозиции, но выиграть в качестве. Уже в 1975 году удалось получить изображение этого белка с разрешением 7 ангстрем (рис. 3, см. R. Henderson, P. N. T. Unwin, 1975. Three-dimensional model of purple membrane obtained by electron microscopy).
Во-вторых, у Хендерсона была возможность ездить по разным научным центрам и пробовать разные электронные микроскопы. Поскольку в те годы не было унификации, у разных микроскопов были свои достоинства и недостатки: разная степень вакуумирования камеры, разная степень охлаждения образца (это позволяет снизить ущерб от облучения электронами), разные энергии электронных пучков, разная чувствительность детекторов. Поэтому возможность исследования одного и того же объекта на разных микроскопах позволила сначала подобрать «наименее неблагоприятные» условия получения изображения, а потом постепенно их улучшать. Так Хендерсон накапливал данные и получал все более и более точную структуру бактериородопсина. В 1990 году вышла его статья, в которой была представлена модель этого белка с атомарным разрешением (R. Henderson et al., 1990. Model for the structure of bacteriorhodopsin based on high-resolution electron cryo-microscopy).
В ходе этого пионерского исследования Хендерсон показал, что криоэлектронная микроскопия может давать изображения с разрешением, которое не хуже, чем у метода рентгеноструктурного анализа - в то время это было прорывом. Правда, этот результат существенно использовал тот факт, что бактериородопсин регулярно располагается в клеточной мембране, и не было понятно, можно ли будет добиться такого разрешения для других, «нерегулярных» молекул.
Проблему обработки слабых сигналов от беспорядочно расположенных биологически активных молекул решил другой лауреат Нобелевской премии 2017 года - Йоахим Франк. Его главный вклад в криоэлектронную микроскопию состоит в создании алгоритмов анализа двумерных изображений, получаемых с помощью криоэлектронной микроскопии, которые позволяют построить качественную трехмерную модель. Подобные алгоритмы уже были разработаны для других методов микроскопии. Франк оптимизировал и во многом уточнил методы математического анализа, позволяющие отделить полезную информацию, полученной в ходе электронной микроскопии, от сигналов, обусловленных шумом. Шумы возникают в точных электронных приборах по разным причинам: случайные колебания силы тока и напряжения могут быть из-за неравномерного испускания электронов в электровакуумных блоках, неравномерности процессов образования и рекомбинации носителей заряда (электронов проводимости и дырок) в полупроводниковых блоках, теплового движения носителей тока в проводниках (тепловой шум), либо внешних наводок (несмотря на то, что все обычно хорошо заизолировано).
Задача усложняется еще и вот чем. Если объекты, пусть даже и одинаковые или примерно одинаковые, как должно быть в подобных исследованиях, неупорядоченны, то они дают немного разные по структуре сигналы, которые могут размывать друг друга. Причем причину такого размытия - шум это или ошибки алгоритма - определить непросто. Схематично принцип обработки данных показан на рис. 5: многочисленные плоские изображения исследуемой молекулы очищаются от шумов и типизируются по «ракурсам», затем из изображений с близкими ракурсами строится более качественный профиль, и, наконец, из этих профилей строится трехмерная модель.
В 1981 году Франк обобщил математические модели в первой версии компьютерной программы SPIDER (System for Processing Image Data from Electron microscopy and Related fields - Система для обработки данных электронной микроскопии и связанных областей, первая публикация: J. Frank et al., 1981. Spider - A modular software system for electron image processing). Этот программный пакет существует и обновляется до сих пор, более того, эти программы свободны к распространению, что, безусловно, облегчает работу ученых во всем мире. Франк использовал собственные алгоритмы для получения изображения поверхности рибосомы - состоящего из нитей РНК и связанных с нею белков органоида клетки, служащего для биосинтеза белка из аминокислот на основе генетической информации.
Приставка «крио-» появилась в электронной микроскопии благодаря третьему лауреату - Жаку Дюбоше. Он разработал метод быстрого охлаждения водных растворов с образцами (J. Dubochet, A. W. McDowall, 1981. Vitrification of pure water for electron microscopy). Причем вода должна замерзнуть так быстро, чтобы молекулы не успели выстроиться в кристаллическую решетку, застывая как попало (см. аморфный лед). Это достигается путем быстрого погружения тонкой пленки раствора с образцом в емкость с жидким этаном, охлажденным до –160°С (рис. 6). Правильный способ заморозки можно назвать ключом к успеху всего метода, так как упорядоченные кристаллы льда могут вызывать дифракцию электронов, искажая информацию об изучаемых молекулах. Из-за большой молекулярной массы белков и нуклеиновых кислот эти молекулы неповоротливы, так что при мгновенной заморозке они не успевают ни изменить свое положение, ни поменять форму. То есть строение биологически активных молекул при быстрой заморозке этим методом не меняется. Пользуясь им, Дюбоше впервые применил криоэлектронную микроскопию для изучения строения вирусов (рис. 7, см. M. Adrian et al., 1984. Cryo-electron microscopy of viruses).
В течение 1990-х и 2000-х годов криоэлектронная микроскопия постепенно развивалась и совершенствовалась с развитием вычислительных мощностей и точности приборов. Но настоящий расцвет криоэлектронной микроскопии начинается с 2012 года. Он связан с появлением прямых электронных детекторов на основе КМОП (CMOS), которые могут напрямую улавливать электроны, прошедшие сквозь образец. Это позволило упростить конструкцию электронных микроскопов, убрав сложные системы фокусировки и преобразования сигнала и уменьшив число узлов, которые могут внести случайный шум. В результате разрешающая способность метода криоэлектронной микроскопии повысилась до 2–3 ангстрем (рис. 8).
Одним из примеров практического применения криоэлектронной микроскопии в этой области можно считать изучение вируса Зика (рис. 10). Во время вспышки эпидемии Зика в Бразилии в 2016 году исследователям хватило несколько месяцев для получения информации о строении вируса методом криоэлектронной микроскопии (D. Sirohi et al., 2016. The 3.8 Å resolution cryo-EM structure of Zika virus).
Другой пример - в этом году криоэлектронная микроскопия позволила получить структуру капсида самого большого представителя семейства вирусов герпеса - цитомегаловируса человека (X. Yu et al., 2017. Atomic structure of the human cytomegalovirus capsid with its securing tegument layer of pp150). Результаты исследования стали основой для поиска возможных участков капсида вирусов, которые могут стать молекулярными мишенями для противовирусных лекарств.
Аркадий Курамшин
Что примечательного в новой Нобелевской премии по химии, зачем вокруг биомолекул замораживать воду и как компьютеры превращают 2D-изображения в 3D, читайте в материале сайт о работе нобелевских лауреатов 2017 года Жака Дюбоше, Иоахима Франка и Ричарда Хендерсона.
Структуры молекул, полученные в последние годы, впечатляют. Здесь и целый «шприц» сальмонеллы, которым она атакует клетки, и белки, которые обеспечивают бактериям устойчивость к антибиотикам, и красивейшие структуры у основания жгутиков, и удивительно красивые ферменты. От фундаментальных биологических знаний о работе биомолекул в клетке до понимания того, как ведут себя молекулы медицинских препаратов, - все это мы можем получить благодаря методу криоэлектронной микроскопии, за развитие которого присудили Нобелевскую премию по химии в 2017 году.
Но что это за метод и почему без него нельзя было добиться тех же результатов? Ведь к тому времени существовала и рентгеновская кристаллография, и просто электронная микроскопия.
Эти методы накладывали на исследователей несколько важных ограничений, за преодоление которых, или, если быть точнее, «за развитие методов криоэлектронной микроскопии для определения структуры биомолекул в растворах с большим разрешением», и была сегодня присуждена престижная награда.
Получат ее в этом году трое ученых, стоявших у истоков этой технологии: француз Жак Дюбоше, который работает в Университете Лозанны, рожденный в Германии Иоахим Франк из Университета Колумбии в Нью-Йорке и шотландец Ричард Хендерсон из лаборатории молекулярной биологии в Кембридже (к слову, это, кажется, уже пятнадцатый лауреат из этой лаборатории).
Слева направо: Жак Дюбоше, Иоахим Франк и Ричард Хендерсон
Denis Balibouse/Reuters, Columbia University, MRC Laboratory of Molecular Biology
Когда Эрнст Руска изобрел и продемонстрировал электронный микроскоп, с помощью которого можно увидеть позиции отдельных атомов (за что Руска получил свою «Нобелевку» в 1986-м), другой ученый, Ладислав Мартон, написал статью о том, что новым методом трудно изучать биологический материал, ведь биомолекулы и клетки разрушаются под действием потока электронов. Этот поток должен был быть очень слабым, чтобы не повредить образцы, но такой слабый поток давал плохое разрешение. Для электронной микроскопии образец должен был быть тонким и плоским, что тоже усложняло задачу - приходилось достраивать 3D-модели изучаемых молекул (например, белков) из двухмерной проекции.
Естественно, об изучении живых клеток не могло быть и речи, а ведь в разрушенном состоянии они выглядят совсем не так, как во время работы. К тому же электронному микроскопу нужен был вакуум, а в нем испарялась вся вода, которая помогала биомолекулам поддерживать их естественную форму. Все это было сложно и неудобно. До тех пор, пока не появилась криоэлектронная микроскопия.
Изменения в изображении биомолекул, связанные с работами нобелевских лауреатов 2017 года
Ричард Хендерсон работал с белками в Кембридже, используя рентгеновскую кристаллографию - метод, с помощью которого Розалинд Франклин получила знаменитые изображения, на основе которых Уотсон и Крик построили модель двойной спирали ДНК . Все было хорошо, пока Хендерсон не занялся мембранными белками, находящимися в оболочке клетки. «Вынутые» из своей естественной среды, они превращались в бесполезную запутанную кучу атомов. Один из них Хендерсон не смог выделить в достаточном количестве, другой не удавалось кристаллизовать.
Все изменилось, когда Хендерсон взялся за светочувствительный белок бактериородопсин. Ученый решил не вытаскивать его из мембраны, а поместил целый кусок мембраны под электронный микроскоп вместе с ним. Чтобы структура не разрушилась, ее покрыли раствором глюкозы. Чтобы не повредить образец мощным потоком электронов, ученые пустили более слабый луч. Изображение, как и ожидалось, вышло не очень четким и контрастным, но тут они применили тот же математический метод, что и при рентгеновской кристаллографии, это позволила сама структура белков, которые располагались в мембране ориентированными в одном и том же направлении. Картинки, полученные с разных углов зрения, показали, что белок извивается, семь раз проходя сквозь мембрану (теперь такие белки известны под названием семиспиральных рецепторов). Это было изображение лучшего качества, когда-либо полученного с помощью электронного микроскопа.
Разрешение в семь ангстрем впечатлило многих, но Хендерсон не желал останавливаться: ему хотелось достичь такого же разрешения, как и при рентгеновской кристаллографии, в три ангстрема. Со временем линзы стали лучше, появились технологии заморозки, позволяющие сохранить образец в жидком азоте. Для получения более четкого изображения бактериородопсина Хендерсон ездил по разным лабораториям, используя лучшие электронные микроскопы в мире. У всех их были те же недостатки, но они дополняли друг друга. И только в 1990 году, спустя 15 лет с получения первой, неказистой на современный взгляд картинки, Хендерсон достиг своей цели. Он показал, что криоэлектронная микроскопия может быть полезна для изучения биомолекул, однако его бактериородопсин был упорядочен и был практически зафиксирован в мембране клетки. Очень мало других белков могут похвастаться тем же, поэтому биологи посчитали, что это все же очень ограниченный метод.
В это самое время по другую сторону Атлантики, в Нью-Йорке, Иоахим Франк уже давно работал над решением этой проблемы. Уже в 1975 году он придумал теоретический подход, но на реализацию его ушло много лет. Его идеей было создать компьютер, который может отличать случайно расположенные белки от хаотичного «заднего плана». Он придумал математический метод, позволяющий компьютеру находить разные повторяющиеся последовательности в изображении. Компьютер сортировал паттерны, объединяя похожие, чтобы получить усредненное, но более резкое изображение. Франк опубликовал несколько работ с двухмерными моделями белков высокого разрешения с разных углов зрения. Алгоритмы были готовы к 1981 году.
Следующим шагом стало создание алгоритма, который находит похожие 2D-картинки и сам собирает их в 3D-структуры. В середине восьмидесятых Франк опубликовал эту часть метода и взялся за грандиозное дело - построение модели поверхности рибосомы, гигантской молекулярной машины для сборки белка в клетке.
Метод анализа 3D-структур, разработанный Иоахимом Франком: 1. Пучок электронов ударяет в случайно ориентированные белки, вследствие чего на изображении остается их отпечаток. 2. Благодаря методам обработки нечеткой информации компьютер группирует получившиеся похожие друг на друга изображения в группы. 3. При помощи получившихся тысяч изображений компьютер составляет 2D-изображение с высоким разрешением. 4. Компьютер анализирует, как 2D-изображения соотносятся друг с другом в пространстве, и создает 3D-изображение с высоким разрешением.
Johan Jarnestad/The Royal Swedish Academy of Sciences
Еще чуть раньше, в 1978 году, другой ученый, Жак Дюбоше, занялся решением третьей части этой проблемы электронного микроскопа. Как мы помним, биомолекулы очень страдали, превращаясь в бесформенную массу, если испарялась вода вокруг них, а в вакуумной камере электронного микроскопа она обязательно испарялась. Простая заморозка не давала результатов: кристаллики льда, расширяясь по сравнению с водой, могли разорвать изучаемый белок и разрушить его структуру. Если Хендерсону повезло с бактериородопсином, то другие ученые мучались с немембранными белками, растворимыми в воде.
Дюбоше придумал сверхбыстрый способ заморозки с помощью жидкого азота: вода как бы «остекленевала», и поток электронов отлично отражался от нее и давал хорошее изображение. Это позволило отлично подготовить биологический материал к работе, что Дюбоше и доказал, опубликовав несколько структур вирусов, полученных этим способом, в 1984 году.
Метод Дюбоше: 1. Металлическое сито, на которое попадает образец, отсеивает лишний материал. 2. Сито помещают в этан с температурой порядка –196°С, в результате чего образец образует тонкую пленку поперек отверстий в сите. 3. Вода превращается в стеклоподобное вещество и окружает образец, затем охлаждается благодаря жидкому азоту во время наблюдений под электронным микроскопом.
Johan Jarnestad/The Royal Swedish Academy of Sciences
С этого момента исследователи начали обращаться к Дюбоше, чтобы научиться его методу. Франк также встретился с ним для того, чтобы получить структуры поверхности рибосомы. Сочетание методов Дюбоше, Франка и Хендерсона легло в основу криоэлектронной микроскопии.
Собственно говоря, именно необходимость получения структуры «живой» рибосомы «двигала» желание поскорее освоить метод: рибосома - одна из основных мишеней действия антибиотиков, для которых очень важно пространственное совмещение с полостями рибосом. И сейчас большинство комплексов потенциальных антимикробных препаратов с рибосомами «смотрит» именно методами криоэлектронной микроскопии.
Метод стал настолько важен, что в мире проводится немало крупных конференций, посвященных именно методу CryoEM, как сокращенно называют его в англоязычной литературе. В 2017 году первая подобная конференция прошла в МГУ.
Решение Нобелевского комитета специально для сайт прокомментировал кандидат физико-математических наук, руководитель отделения молекулярной и радиационной биофизики Петербургского института ядерной физики имени Б.П. Константинова Андрей Коневега, научная группа которого в своей работе часто использует методы CryoEM:
«Криоэлектронная микроскопия совершила революцию в структурной биологии, поскольку именно этот метод позволяет делать визуализацию макромолекул с высоким разрешением, причем сейчас уже с таким разрешением, как рентгеновская кристаллография, но при этом без необходимости превращать белки в кристалл. То есть все биомолекулы во время исследования находятся в своем естественном состоянии. За последнее десятилетие в этом методе произошел качественный скачок в качестве получаемых структур, в разрешении. Это стало возможным благодаря технологическому прогрессу: новые микроскопы, новые камеры, новые методы обработки. Что важно, у биологов появились достаточно мощные вычислительные комплексы для того, чтобы обработка занимала дни, а не месяцы и не годы. Мы сами в России обладаем такими центрами обработки данных в НИЦ " " в Москве и в НИЦ "Курчатовский институт"-ПИЯФ в Гатчине, поэтому мы активно пользуемся ими для обработки своих данных».
О премии:
За 117 лет было вручено 109 премий по химии (как и в других дисциплинах, были годы, когда премия не присуждалась из-за войны или когда Нобелевский комитет не пришел к согласию). Самую первую премию в 1901 году получил Якоб Хендрик Вант-Гофф . За все время в Стокгольме были объявлены имена 178 лауреатов. Правда, премию получили всего 177 человек: Фредерик Зангер стал единственным человеком в истории, получившим награду дважды.
Средний возраст лауреатов премии (без учета премии 2017 года) - 58 лет. Самым молодым был Фредерик Жолио-Кюри, получивший премию в 1935 году в возрасте 35 лет, самым пожилым - Джон Фенн: нобелиату 2002 года было 85 лет. Кстати, премия не очень легко «поддается» женщинам: за 117 лет - всего четыре лауреата, причем половина из них из одной семьи . В 1911 году премию получила Мария Кюри , в 1935 - ее дочь Ирен. Еще половина - за ту самую рентгеновскую кристаллографию, с которой конкурирует криоэлектронная микроскопия. В 1964 году премией наградили Дороти Кроуфут Ходжкин за рентгеноструктурный анализ биомолекул, а в 2009 году лауреатом стала Ада Йонат, применившая эту методику для установления структуры рибосомы.
Доброй традицией Нобелевского комитета становится признание значимости методик, позволяющих «разглядеть» отдельные атомы: в 2014 году отметили сверхразрешающую микроскопию , а 4 октября 2017 года Нобелевскую премию по химии присудили «за разработку метода криоэлектронной микроскопии». Лауреатами стали трое исследователей: Жак Дюбоше из Университета Лозанны, Йохим Франк из Колумбийского университета в Нью-Йорке и Ричард Хендерсон из Лаборатории молекулярной биологии в Кембридже. Заморозка биомолекул в движении позволяет получать их изображения в высоком разрешении, а методики компьютерной реконструкции дают пространственную структуру с точностью до атома. Исследование, начатое еще в 1970-е годы, все лучше и лучше позволяет оценивать архитектуру биоорганических комплексов.
Люди, регулярно читающие статьи в топовых научных журналах, давно уже привыкли к многочисленным молекулярным изображениям. Но микроскопы не позволяют увидеть отдельные молекулы . Правда, существует микроскопия сверхразрешения, за которую в 2014 году дали Нобелевскую премию по химии , но и она не позволяет «разглядеть» отдельные атомы. Изучать строение биологических молекул с такой подробностью - удел структурной биологии , лидирующими методиками которой до недавнего времени считались рентгеноструктурный анализ (РСА) и спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Интересным методом также является атомно-силовая микроскопия , но герой нашего сегодняшнего рассказа другой: это криоэлектронная микроскопия , за разработку которой вручена Нобелевская премия по химии уже этого, 2017 года .
Визуализация сложных структур, прежде считавшихся «невидимыми» ввиду их малых размеров, позволила совершить множество фундаментальных прорывов. Один из них - прогресс в борьбе с вирусом Зика , (рис. 1), недавно вызвавшим пандемию одноименной болезни. Благодаря криоэлектронной микроскопии, в последние пять лет все более прочно входящей в «большую тройку» методов структурной биологии, удалось получить трехмерную модель этого коварного агента. Что, в свою очередь, положило начало поиску потенциальных мишеней для лекарственных веществ, способных справиться с болезнью.
Рисунок 1. Примеры некоторых белковых комплексов. а - Белковый комплекс, регулирующий циркадный ритм. б - Комплекс звукового сенсора уха, считывающий изменения давления и позволяющий нам слышать. в - Модель вируса Зика.
Краткий экскурс в историю микроскопии до 1975 года
Всю первую половину 20 века три самых известных биологических структуры - ДНК, РНК и белок - оставались белым пятном на карте биохимического мира. Было известно, что они есть в организме и играют важную роль в жизни клеток, но каково их строение - никто не имел ни малейшего понятия. Лишь в начале 1950-х годов знаменитая группа ученых из Кембриджа, включавшая Френсиса Крика, Джеймса Уотсона, Мориса Уилкинса и Розалинд Франклин, впервые попробовала облучать ДНК рентгеновскими лучами, что привело к открытию прославленной двойной спирали.
К кристаллографам относился поначалу и Ричард Хендерсон , получивший за свои ранние исследования пусть не Нобелевскую премию, но докторскую степень. Метод рентгеноструктурного анализа заключается в дифракции рентгеновских лучей на кристаллической решетке, что помогает идентифицировать структуру молекулы. Но в то время он был еще далек от совершенства, хотя сегодня это один из основных способов изучения структуры вещества . Шагнув на 30 лет вперед, мы узнаем, что наука получила еще один способ расшифровывать строение биомолекул: в 1980-х годах для изучения структуры и динамики белков в растворе начали применять метод ядерного магнитного резонанса (и применяют до сих пор ).
Благодаря этим двум методам удалось накопить внушительные объемы информации по строению биологических молекул: на сегодня в базе PDB находится более 100 тыс. структур. Но, как это часто бывает, и у того, и у другого метода есть свои недостатки. Так, с помощью ЯМР можно визуализировать только белки, находящиеся в растворе, и размер их должен быть небольшим. А минус рентгеновской кристаллографии считывается в названии метода: он работает на стабильных структурах типа кристаллов, но не на динамических «живых» молекулах. Изображения, полученные с помощью этого метода, напоминают снимки первых в истории фотокамер: черно-белые и застывшие, не несущие в себе информации о подвижной структуре белка. Эта проблема заставила Ричарда Хендерсона бросить рентгеновскую кристаллографию в 1970-х, что и стало отправной точкой на его пути к Нобелевской премии 2017 года.
Шаг первый: бактериородопсин под прицелом электронного пучка
Хендерсона с самого начала интересовали мембранные белки. Почему же их визуализация оказалась неподвластна рентгеновскому методу на тот момент? Неудачи возникали при попытках кристаллизовать белок, тем самым нарушая его естественное состояние в липидной мембране клетки. Мембранные белки крайне трудно извлекать из мембраны, не нарушая их нативного состояния : очень часто они просто «слипаются» в единую массу, неподвластную дальнейшему изучению. Впрочем, сейчас и в кристаллизации мембранных белков есть большой прогресс: мембрану просто научились делать частью кристалла .
После ряда неудачных попыток Ричард Хендерсон обратился к единственному, казалось, реальному варианту: электронной микроскопии. В чем принципиальное отличие электронного микроскопа от оптического? В просвечивающей электронной микроскопии (так называется эта техника) вместо пучка света к образцу посылается луч электронов. Длина волны электронов намного меньше, чем длина волны света, поэтому с помощью электронного микроскопа можно визуализировать даже очень маленькие структуры - вплоть до уровня отдельных атомов.
В теории электронный микроскоп идеально подходил для исследований Ричарда Хендерсона - ведь он позволял получить изображения мембранных белков на атомном уровне. Но на практике эта идея казалась нереальной. Со времен изобретения электронного микроскопа считалось, что с помощью этого метода можно изучать исключительно неживую материю. Виной тому электронный пучок: он позволяет получать картинки с высоким разрешением, но фактически «сжигает» на своем пути живые структуры. Если же снизить его интенсивность, то изображение теряет контраст и получается нечетким.
Дополнительной преградой на пути визуализации биомолекул под электронным микроскопом является необходимость создания вакуума. При выкачивании воздуха из биологического образца испаряется и вода, обволакивающая живые структуры, из-за чего они теряют свою естественную форму. Таким образом, все обстоятельства выступали против Хендерсона. Однако его идею спас особый белок, обладающий исключительной стабильностью в мембране - бактериородопсин.
В 1991 году Йоахим Франк «заморозил» рибосомы по методу Дюбоше, получив на выходе изображение их трехмерной структуры. И, несмотря на то, что картинка была сделана в небывалом для электронной микроскопии разрешении, исследователям удалось показать лишь очертания рибосомы. Странные каплевидные структуры все еще не выдерживали сравнения с атомным разрешением рентгеновской кристаллографии. Криоэлектронная микроскопия позволяла визуализировать лишь неверные контуры электронной плотности, напоминающие пузыри, из-за чего этот метод в шутку называли «блобология» (blobology ) . Но прогресс идет вперед, и после 2010 года получил распространение новый тип электронного детектора - Direct Electron Detector , позволяющий получать гораздо более детальное изображение биологических структур .
Сегодня криоэлектронная микроскопия позволяет «ловить» биологические структуры «в динамике» на разных этапах. Совмещая полученные снимки, исследователям удается создавать целые фильмы, демонстрирующие перемещения и взаимодействия белков с другими молекулами. За последние пять лет чуть ли не каждая вторая молекулярная структура, опубликованная в журналах уровня Science и Nature , криомикроскопическая: это и новые состояния рибосомы , и АТФазы , и различные рецепторы , и филаменты загадочного тау-пептида , и инфламмосома , и термочувствительный ионный канал TRPV1 , и многое другое. И это только начало: ученым еще предстоит определить точную структуру и механизм работы множества белков и других сложных биологических структур.
Литература
- 12 методов в картинках: микроскопия ;
- По ту сторону дифракционного барьера: Нобелевская премия по химии 2014 ;
- 12 методов в картинках: структурная биология ;
- Атомно-силовая микроскопия: увидеть, прикоснувшись ;
- Fernholm A. (2017).
По сложившейся традиции - Нобелевские премии 2017 года в «научных» номинациях достались не отдельным ученым, а группам исследователей, состоящим из 2-3 человек. А вот в двух "гуманитарных" дисциплинах награды оказались персональными.
Нобелевская премия по физике за 2017 г. за открытие гравитационных волн
Ее получили американские физики Райнер Вайсс (Rainer Weiss), Кип Торн (Kip Thorne) и Барри Бэриш (Barry Barish), под руководством которых в США был реализован проект LIGO.
Нобелевские лауреаты 2017 года: Райнер Вайс, Кип Торн и Барри Бэриш («Физика»)
Его главными элементами являются две обсерватории в штатах Вашингтон и Луизиана, удаленные друг от друга на 3002 км. Поскольку скорость распространения гравитационных волн равна скорости света, данное расстояние «гравитация» преодолевает ровно за 10 миллисекунд, что облегчает расчеты. Обсерватории представляют собой интерферометры Майкельсона, совмещенные с двумя мощными лазерами. Их использование позволяет установить направление на источник гравитационных флуктуаций и определить их силу.
Еще 14 сентября 2015 г. до Земли дошла гравитационная волна от столкновения двух массивных черных дыр, которые находились на расстоянии 1,3 млрд. световых лет от Солнечной системы. Ее то и удалось зарегистрировать с помощью обсерваторий LIGO, подтвердив тем самым экспериментально само наличие гравитационных волн. Необходимо отметить, что их существование предсказал еще Альберт Эйнштейн в далеком 1915 г. в рамках Общей Теории Относительности.
Но теория – это одно, а практика – совсем другое, решили в Нобелевском комитете и, совершенно заслуженно присудили премию трем американским физикам.
Открытие гравиволн - действительно фундаментально, поскольку способно стать отправной точкой для развития систем связи на основе гравитационного взаимодействия, а в далеком будущем – и создания транспортных средств для путешествий (в т.ч. межзвездных) через «изнанку пространства», которые многократно описаны фантастами.
Нобелевская премия по химии за 2017 г. за развитие криоэлектронной микроскопии
Была присуждена швейцарцу Жаку Дюбоше (Jacques Dubochet) из университета Лозанны, американцу Иоахиму Франку (Joachim Frank) из Колумбийского университета и британцу Ричарду Хендерсону (Richard Henderson) из Кембриджа.
Нобелевские лауреаты 2017 года: Жак Дюбоше, Иоахим Франк и Ричард Хендерсон («Химия»)
Несмотря на то, что они работают в разных организациях, ученые кооперировались друг с другом. В результате им удалось добиться небывало высокого разрешения изображений биомолекул, для чего они использовали особые растворы. Суть метода криомикроскопии заключается в быстром замораживании исследуемого биоматериала в жидком азоте или этане без его кристаллизации. Это позволяет увидеть вирус, митохондрию, рибосому или отдельный белок именно такими, какими они есть на самом деле. Используя электронные микроскопы и специальную методику визуализации, ученые создали карты целого ряда белков в разрешении порядка 2 Ангстрем (2 мкм).
На полученных изображениях можно различить отдельные атомы углерода или кислорода, входящие в состав белков и ферментных комплексов. Данное достижение невозможно переоценить, поскольку оно предоставляет биохимикам великолепный инструмент для исследований.
Как указано в пресс-релизе Нобелевского комитета, открытие трех лауреатов премии за 2017 г., - «переместило биохимию в новую эру».
Теперь структуру ДНК можно визуализировать не схематически, а иметь реалистичную картинку «as is», что наверняка поможет в достижении самых разных целей. Например, открываются отличные перспективы в оценивании воздействия лекарств на самые тонкие структуры организма, а также в генном модифицировании. Как ожидается, новые методы криоэлектронной микроскопии позволят сделать, возможно, решающий шаг в разработке лекарства от рака.
Нобелевская премия по физиологии за 2017 г. за исследование биологических ритмов
Досталась американским генетикам Джефри Холлу (Jeffrey Hall), Майклу Росбашу (Michael Rosbash) и Майклу Янгу (Michael Young).
Этим ученым удалось осуществить прорывное исследование в области т.н. «циркадных» циклов, отвечающих за периоды сна и бодрствования у всех живых существ на планете. В отличие от предшественников (а изучение биоритмов ведется еще с 18-го века), нобелевские лауреаты обнаружили особый ген, контролирующий биологические часы. В качестве объектов исследования были выбраны обыкновенные плодовые мушки, поколения которых сменяются всего за несколько суток, что очень удобно.
Биохимические эксперименты показали, что найденный ген кодирует специальный белок, причем в течение ночи это вещество накапливается в организме, а днем – постепенно разрушается.
Ученые тщательно проанализировали, как это происходит у дрозофил, а затем экстраполировали полученные данные на более сложные организмы, включая человека. Как выяснилось, биологические часы работают примерно одинаково у всех живых существ, регулируя целый ряд функций организма – температуру, давление, гормональный фон и в конечном итоге – циклы сна.
Полученные результаты обещают окончательное решение проблемы бессонницы, которая мучает десятки миллионов людей. Причем, средством против расстройств сна уже в скором времени будет не вредная химия, а абсолютно естественный для человека белок (если нужно бодрствовать) или его разрушитель (когда необходимо заснуть). Кроме того, открытие нобелевских лауреатов в недалеком будущем наверняка улучшит качество жизни людей, работающих в ночную смену или имеющих скользящий график.
Нобелевская премия по экономике за 2017 г. за изучение «поведенческой экономики»
Досталась американскому экономисту Ричарду Талеру (Richard Thaler) за разработку целого раздела экономической теории, который получил неофициальное название - «экономика с человеческим лицом».
Нобелевский лауреат 2017 года: Ричард Талер («Экономика»)
Эта дисциплина изучает нерациональное поведение людей и целых организаций, выбирающих товары и услуги. Давно известно, что факторами такого выбора являются не только прямая выгода, но и социальные, эмоциональные, когнитивные и даже религиозные аспекты. Все это не учитывается большинством современных экономических теорий, которые исходят из того, что в основе экономики лежит исключительно прямая выгода. Нобелевский лауреат 2017 г. убедительно обосновал ущербность такого подхода, а также доказал, что «полезность» может лежать не только в материальной плоскости, но и в области чувств.
Почему дорогие «айфоны» успешно конкурируют на мировом рынке с объективно не менее качественными, но дешевыми «самсунгами»? В т.ч. и на этот вопрос отвечает поведенческая экономика Ричарда Талера
В рамках поведенческой экономики Ричард Талер подробно исследовал такие моменты, как эвристика доступности, влияние толпы (ввел понятие «информационные каскады»), феномен избыточной уверенности, который заставляет людей делать объективно ошибочный выбор товара или услуги. Есть надежда, что новая экономическая теория «с человеческим лицом» позволит точнее прогнозировать развитие потребительских рынков и экономики в целом.
Нобелевская премия по литературе за 2017 г. за романы «невероятной эмоциональной силы»
Вручена британскому писателю японского происхождения Кадзуо Исигуро (Kazuo Ishiguro) за глубокое проникновение во внутренний мир людей, осознающих «иллюзорность своих связей с миром».
Нобелевский лауреат 2017 года: Кадзуо Исигуро («Литература»)
Как отмечают эксперты-литературоведы, в 2017-м году Нобелевский комитет наконец-то отказался от политизации премии по литературе, как это было, например, два года назад, когда «нобелевку» получила малоизвестная писательница Светлана Алексиевич. Не исключено, что главная ее заслуга, повлиявшая на выбор жюри – откровенно русофобские произведения и высказывания. В отличие от Алексиевич, Кадзуо Исигуро – действительно признанный мастер прозы, уже получавший Букеровскую премию и издавший свои произведения миллионными тиражами.
Его книга «Не отпускай меня» была включена в сотню лучших английских романов по версии журнала «Τime», а сразу несколько работ мастера были экранизированы, в частности, роман «Белая графиня». Последнюю свою книгу «Погребенный великан» Кадзую Исигуро написал в модном нынче жанре фэнтези, однако Нобелевскую премию получил не за него, а как бы по сумме результатов своего творчества, что вполне справедливо и заслуженно. Романы этого японо-британского писателя переведены на 40 языков, в т.ч. на русский.
Нобелевская премия Мира за 2017 г. за борьбу против ядерного оружия
Была вручена организации, которая называется «Международная кампания за запрет ядерного оружия» - в английской аббревиатуре ICAN.
Этот результат стал для многих неожиданным, поскольку ожидалось, что нобелевским лауреатом-2017 в области борьбы за мир станет папа римский Франциск или же канцлер Германии Ангела Меркель. Нобелевский комитет сумел удивить наблюдателей, в последний момент сделав выбор в пользу ICAN. Данная организация объединяет политиков, общественных деятелей, а также простых людей из 101-й страны мира и ставит целью полный запрет ядерного оружия на Земле.
ICAN регулярно проводит массовые акции против нуклеаризации планеты, ведет разъяснительную работу и лоббирует антиядерные законы в различных странах. Конечная цель организации – мир без ядерных бомб, выглядит несколько утопично, но возможно это и стало причиной присуждения ICAN Нобелевской премии Мира.